Před 10 lety konsenzuální panel veterinárních onkologů na společném setkání zástupců Evropské společnosti veterinární onkologie (ESVONC) a Společnosti pro veterinární nádory (VCS) se sídlem ve Spojených státech amerických doporučil vyšetření somatických mutací c-kit jako běžnou součást diagnostiky a prognostiky mastocytomů u psů.
Nádory z žírných buněk patří mezi nejčastější národová onemocnění psů a koček. Mohou mít benigní lokalizovaný charakter i agresivní maligní chování s tvorbou metastáz. K určení prognózy je třeba vzít v úvahu lokalizaci nádoru a výsledky jeho histopatologického vyšetření – typing, grading a staging. Vhodné je doplnit histopatologické vyšetření také imunohistochemickými nebo molekulárněbiologickými vyšetřeními. Na základě těchto údajů je pak volena léčebná strategie. V terapii se mohou uplatnit všechny dostupné modality, tedy chirurgická resekce, radioterapie i chemoterapie.
C-kit je gen kódující protein KIT, jenž slouží jako tyrosinkinázový receptor pro růstový faktor SCF (stem cell factor). Mutace tohoto genu mohou vést ke konstitutivní aktivitě receptoru (tj. i bez přítomnosti ligandu). Jedněmi z těchto mutací jsou např. tandemové duplikace v exonu 11, které patří u mastocytomů mezi nejčastěji popisované a tvoří asi 65 % všech mutací. Další významné mutace jsou popisovány v exonech 8 a 9.
Mutace c-kit korelují s agresivitou nádoru z žírných buněk, jsou častější u grade II a grade III, u recidivujících, metastatických a fatálních případů a negativně korelují s kompletní remisí a přežíváním pacientů.
Mutace exonu 11 se objevují u 20−30 % psích kožních mastocytomů. Tyto vykazují vysokou agresivitu, ale zároveň je 2× vyšší pravděpodobnost, že budou reagovat na terapii tyrosinkinázovými inhibitory (toceranib, masitinib). Mutace v exonu 8 jsou vzácnější, vyskytují se u 2−5 % kožních mastocytomů u psů. Mají výrazně lepší prognózu než tumory s mutací v exonu 11 či bez mutace a rovněž dobře reagují na inhibitory tyrosinkinázy.
Screening se provádí metodou polymerázové řetězové reakce (PCR) následované kapilární fragmentační analýzou a sekvenací. Nádory jsou však obvykle heterogenní masou a k vyšetření statusu c-kit je třeba biopticky odebrat maximální množství nádorových buněk. I přes snahu o odebrání reprezentativního vzorku tumoru v něm může být zachycen jen malý podíl mutovaných oproti wild-type (nemutovaným) alelám. Při stanovení je tak potřeba zvýšit signál mutovaných alel ve vzorku, což ne všechny molekulárněbiologické techniky umožňují.
Při běžné PCR totiž dochází k amplifikaci majoritních (nemutovaných) i minoritních (mutovaných) forem DNA se stejnou účinností. K posílení amplifikace mutovaných alel je vhodnou metodou COLD-PCR. Ta pracuje se závislostí teploty tání na sekvenci DNA, přičemž teplotou tání (Tm) se rozumí teplota, při které je molekula dvoušroubovicové DNA denaturována do jednořetězcové formy, jež je v dalších fázích PCR cyklu přístupná nasednutí primerů a amplifikaci (zmnožení) úseku. U dvou různých amplikonů, rozdílných v jednom nukleotidu, se teploty tání (Tm) liší o 0,2−1,5 °C.
Na počátku reakce se při metodě COLD-PCR provede krok se standardní denaturační teplotou 95 °C. V následujících cyklech se již volí teplota nižší, při které se denaturují a amplifikují jen vybrané mutované úseky. Díky tomu se vytvoří dostatek kopií mutovaných alel k následujícímu vyšetření pomocí kapilární fragmentační analýzy a sekvenace.
Detekce mutací c-kit u mastocytomů umožňuje lépe stanovit prognózu onemocnění a vybrat vhodnou terapii. Mastocytomy, u kterých byla detekována mutace c-kit, významně lépe odpovídají na terapii inhibitory tyrosinkinázy než nádory bez mutace. Na druhou stranu jsou agresivnější, s vyšší pravděpodobností výskytu metastáz a s kratší dobou přežití.
Absolutní výhoda metody COLD-PCR spočívá v tom, že dokáže zesílit signál mutovaných alel ze vzorků tkání bez nutnosti analýzy exprese RNA nádorových buněk. RNA rychle degraduje, a proto vzorek určený pro stanovení exprese vyžaduje speciální zacházení, rychlou přepravu a rychlé zpracování. Naopak COLD-PCR pracuje s genomovou DNA, která je stabilní a speciální podmínky nevyžaduje. Metodou COLD-PCR lze zpracovat vzorky biopsií (nativní i zmražené), cytologické vzorky (barvené i nebarvené) a histologické vzorky (řezy montované na skle). Využití této metody v detekci c-kit ve veterinární onkologii pomáhá lépe určit prognózu pacienta, a vybrat tak pro něj nejvhodnější léčbu. Analýzu mutací v genu c-kit je možné objednat v laboratoři Genomia.
(jam)
Zdroje:
1. Genomia: Testování psů: PCR vyšetření mutací c-kit. Dostupné na: www.genomia.cz/cz/test/ckit-canine
2. Milbury C. A., Li J., Liu P. et al. COLD-PCR: improving the sensitivity of molecular diagnostics assays. Expert Rev Mol Diagn 2011; 11 (2): 159‒169, doi: 10.1586/erm.10.115.
3. Kiupel M., Smedley R. C., Sledge D. G. Prognostication of canine and feline mast cell tumors and c-Kit PCR testing. Hope VS 2017 Apr 28. Dostupné na: http://hopevs.com/2017/04/28/prognostication-canine-feline-mast-cell-tumors-c-kit-pcr-testing
