Molekulární analýza klonality lymfocytů

Antigenové receptory lymfocytů a jejich variabilita

Antigenové receptory T a B lymfocytů jsou složeny z řetězců, jež jsou každý kódovaný lokusem v odlišné oblasti chromosomu. Na rozdíl od jiných genů nemají geny antigenových receptorů lymfocytů konstantní nukleotidové sekvence. Každý řetězec je vytvořen přeskupením několika menších genových segmentů, a tím se vytvoří jedinečná sekvence. Existují celkem 4 typy těchto genových segmentů: V (variable), D (diversity), J (joining) a C (constant). Během genové přestavby je náhodně vybráno z každé skupiny po jednom segmentu a ty jsou pak spojeny v pořadí V–D–J. Vzniká tak tzv. komplementaritu určující oblast 3 (CDR3), jež je unikátní pro každý klon lymfocytů a determinuje specificitu antigenového receptoru. Tato oblast je pak ještě spojena s konstantním segmentem C. Výsledkem složité kombinace jsou zcela unikátní sekvence DNA kódující obrovské množství antigen-specifických receptorů. Tento proces tak zajišťuje značnou biologickou variabilitu a umožňuje fungování adaptivní imunity.

Molekulární analýza klonality

Molekulární analýza klonality vizualizuje rozmanitost antigenových receptorů. Analýza využívá amplifikace CDR3 polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) a následnou elektroforetickou separaci fragmentů. Při reaktivní imunitní odpovědi jsou aktivovány klony mnoha různých lymfocytů, které se liší délkou CDR3; při PCR tak vznikají amplikony různých délek a tvoří tzv. polyklonální křivku. Naopak při nádorových procesech jsou lymfocyty odvozeny od jediné buňky, a mají tudíž identické CDR3. Při PCR se proto tvoří amplikony stejné velikosti, které generují tzv. klonální peak. Metoda PCR využívá dva primery definující oblasti (V a J), amplifikace pak proběhne jen v přestavěných úsecích. Základem je identifikace přeskupení segmentů V a J k výběru potřebných primerů. Pro optimální návrh analýzy a interpretace testů klonality je definování segmentů V a J zásadní.

Vzorky a provedení analýzy

Test klonality se provádí z genomové DNA. Jako vstupní materiál lze využít cytologické i histologické tkáně, biopsie nebo tělní tekutiny, které obsahují „podezřelé“ lymfocyty. DNA by měla být extrahována z částí vzorku, jež byly mikroskopicky vyšetřeny, aby bylo možné porovnat morfologické, imunofenotypizační a molekulární nálezy. Barvení ani zmražení vzorkům neškodí. Tkáně fixované formalinem a parafinem mají fragmentovanou DNA a nejsou pro analýzu ideální. Vhodné nejsou ani tkáně, které obsahují velké množství normálních lymfocytů (mízní uzliny). Teoreticky je nejvhodnější do testování klonality zahrnout všechny lokusy antigenových receptorů, jež kódují B a T lymfocyty. Nicméně ve veterinární medicíně je vyšetření výrazně limitováno financemi. Proto je zařazení imunofenotypizace před analýzou klonality nezbytné pro optimální výběr cíle a také pro správnou interpretaci výsledků klonality. U B lymfocytů se analýza zaměřuje na lokus IGH (těžký řetězec receptorů B lymfocytů), u T lymfocytů na lokus TRG.

PCR by měla probíhat minimálně v duplikátech, aby bylo možné odhalit tzv. pseudoklonalitu (amplifikace jen několika málo přeskupení, což může být chybně interpretováno jako klonální přeskupení). 

Indikace a limitace metody

Testování klonality lymfocytů by nemělo být prvním ani jediným nástrojem v diagnostice lymfoidních malignit. Význam má při hodnocení netypických, smíšených nebo maturovaných lymfoproliferací, zejména v případech, kdy je obtížné je odlišit od reaktivní proliferace fyziologických lymfocytů. Testování klonality může být využito i pro sledování neoplastických klonů v čase (monitorování vývoje onemocnění a účinnosti terapie) nebo v různých anatomických lokacích. Výsledek testu je vždy nutné posuzovat s ohledem na klinický nález a morfologické i imunofenotypové charakteristiky vzorku.

(eza)

Zdroj: Keller S. M., Vernau W., Moore P. F. Clonality testing in veterinary medicine: a review with diagnostic guidelines. Vet Pathol 2016 Jul; 53 (4): 711−725, doi: 10.1177/0300985815626576.